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Estudio de factores proteicos asociados a la regulación de los genes HSP70 en Leishmania braziliensis
Get PDFLa leishmaniasis constituye un grupo de enfermedades producidas por parásitos
protozoos pertenecientes al género Leishmania. Durante su ciclo de vida, el parásito
alterna entre un vector invertebrado y un hospedero vertebrado, lo que le exige
desarrollar cambios morfológicos y bioquímicos que le permitan sobrevivir y adaptarse al
estrés celular que debe enfrentar en ambos hospederos. Adaptación que depende de la
regulación de la expresión de una amplia variedad de genes, dentro de los cuales se
encuentran los genes HSP70. Se ha demostrado que estos parásitos, tanto del
subgénero Leishmania como del subgénero Viannia, poseen dos tipos de genes HSP70
(HSP70-I y II), los cuales se diferencian en su región 3´ no traducida (3´ UTR); diferencias
relacionadas con los mecanismos moleculares de adaptación del parásito para tolerar el
estrés térmico al que es sometido durante su ciclo de vida. Ensayos recientes, en L.
braziliensis, han identificado proteínas con afinidad a las regiones UTR de los ARNm de
estos genes, hallazgo de gran importancia teniendo en cuenta que la regulación de su
expresión génica ocurre principalmente a nivel postranscripcional, y está mediada por la
interacción entre elementos reguladores cis y trans del parásito. Entre las proteínas
identificadas en dicho estudio se encuentran las proteínas LbrM.25.2210 (SCD6) y
LbrM.30.3080 (RBP42), para las cuales, en esta Tesis, se estudiaron sus características
moleculares y funcionales como factores proteicos implicados en la regulación génica en
Leishmania.
Inicialmente, se confirmó la capacidad de estas proteínas para interactuar de forma
directa con moléculas de ARN. Observándose que estas proteínas son capaces de
interactuar con un motivo con características de elemento ARE. Por otra parte, la
interacción de estas proteínas con moléculas de ARN también fue demostrada in vivo,
encontrándose asociados varios transcritos codificantes para proteínas relacionadas con
el metabolismo y degradación celular. De forma particularmente destacable, asociada a
la proteína RBP42 se identificó el transcrito correspondiente al gen HSP70-II. Así mismo,
se encontraron asociaciones de las proteínas de estudio con transcritos codificantes para
proteínas involucradas en la diferenciación y sobrevivencia del parásito en condiciones
de choque térmico.
Con el propósito de dilucidar los posibles procesos biológicos en los cuales podrían estar
involucradas estas proteínas se determinó el interactoma de cada una de ellas. Cabe
destacar que los interactomas comparten una alta proporción de proteínas, lo que
sugiere algún tipo de relación funcional; de hecho, las dos proteínas forman parte de los
interactomas recíprocos. Ambos interactomas están enriquecidos en proteínas
asociadas a los procesos de traducción, metabolismo de ARN y regulación de la
expresión génica. Como apoyo a un posible papel de estas proteínas en la regulación
postranscripcional, cabe indicar que se encontraron varias proteínas cuyos homólogos
han sido reportados como constituyentes de gránulos de ARN, principalmente cuerpos
de procesamiento y gránulos de estrés.
Finalmente, para analizar la función de SCD6 y RBP42 se generaron líneas mutantes de
parásitos que sobreexpresan las proteínas fusión SCD6-mCherry y RBP42-mCherry. La
línea sobreexpresante control (expresión de la proteína mCherry) de L. braziliensis pudo
ser establecida, pero, por el contrario, las líneas de sobreexpresión para cada una de
estas proteínas, luego de una semana de crecimiento, perdieron viabilidad. Estos
resultados, si bien no concluyentes, sugieren que la sobreexpresión de SCD6 y RBP42
en L. braziliensis afecta negativamente al desarrollo y sobrevivencia del parásito. Como
alternativa, se logró, generar estas líneas de sobreexpresión utilizando la especie L.
major, lo que permitió determinar importantes implicaciones de estas proteínas en el
desarrollo de los parásitos; observándose alteraciones morfológicas significativas y el
retardo del crecimiento de los parásitos en condiciones fisiológicas de crecimiento,
siendo el efecto mucho más pronunciado en condiciones de estrés térmico. Por otra
parte, la capacidad infectiva in vitro de estos parásitos mutantes resulta
significativamente afectada en relación con la cepa silvestre.
En conjunto, este estudio aporta la caracterización de las proteínas SCD6 y RBP42 como
proteínas de unión a ARN que, junto al resto de análisis complementarios sugieren su
relevante implicación en la regulación de la estabilidad o degradación de un amplio grupo
de transcritos en Leishmania.Pontificia Universidad JaverianaLeishmaniasis is a disease caused by protozoan parasites of the Leishmania genus.
These parasites present a complex digenetic life cycle alternating between invertebrate
and vertebrate hosts. Therefore, these parasites must develop morphological and
biochemical changes that allow them to survive the host defense mechanisms and adapt
to the intracellular environment within the human phagocytic cells. This adaptation
depends on the regulation of a wide variety of genes, and the HSP70 genes are found
among them. Parasites of Leishmania and Viannia subgenera present two types of
HSP70 (HSP70-I and II) genes, which differ in their 3’ untranslated regions (3’ UTR);
these differences would be related to the molecular mechanisms regulating the
adaptation to the thermal stress that the parasite suffers through its life cycle. Recent
assays in L. braziliensis have identified different proteins with affinity to the UTRs of these
genes, results of great importance considering that the regulation of gene expression in
these parasites occurs mainly at the posttranscriptional level, mediated by the interaction
between cis and trans regulatory elements. Among the proteins identified, the
LbrM.25.2210 (SCD6) and LbrM.30.3080 (RBP42) were the focus of this Thesis, in which
their molecular and functional characterization was undertaken, considering their putative
function as protein factors involved in the gene regulation in Leishmania.
Initially, we confirmed the capacity of SCD6 and RBP42 proteins to directly interact with
RNA molecules, particularly, with a RNA motif related to the ARE elements. On the other
hand, the binding capacity of these proteins in vivo was also demonstrated, finding
several transcripts associated to SCD6 and RBP42 proteins. Transcripts involved mainly
in metabolism pathways and cellular proteolysis. Remarkably, the transcript corresponds
to the HSP70-II gene was identified associated with the RBP42 protein. Likewise,
transcripts involved in the differentiation and survival of the parasites in thermal stress
conditions, were found associated both to SCD6 and RBP42 proteins.
In order to elucidate the possible biological processes in which these proteins could be
involved, the interactome of each protein was determined. Notably, the interactomes
share a high proportion of proteins, suggesting some type of functional relationship; in
fact, both proteins were identified in the reciprocal interactomes. The interactomes are
enriched in proteins associated with translation, RNA metabolism and regulation of gene
expression processes. In support of a possible role of SCD6 and RBP42 proteins in the
post-transcriptional regulation was the finding of several proteins, whose homologues
have been reported as constituents of RNA granules, mainly processing bodies and
stress granules.
Finally, to analyze the SCD6 and RBP42 function, overexpressing lines of parasites were
generated. Initially, transfection assays using constructions expressing either SCD6 or
RBP42 proteins, fused to the mCherry protein, were done in L. braziliensis parasites.
Whereas the control parasite line (parasites that express the mCherry protein) was
obtained, the parasites overexpressing SCD6 or RBP42, however, after one week of
growth, lost their viability. These results, while not conclusive, could indicate that SCD6
and RBP42 overexpression, negatively affects the development and survival of the
parasites. As an alternative, it was tried, with successful results, to generate the
overexpression lines in L. major parasites; these lines allowed us to determine important
implications of these proteins in the developmental of the parasites. Significant
morphological alterations were observed together with a lower rate of growth, whose
more drastic effect was better observed when the parasites were grown at 37ºC. On the
other hand, the infective in vitro capacity of these mutant parasites was significantly
affected, as well as their intracellular proliferation rate, regarding the wild type strain.
Overall, this study describes the structural features of SCD6 and RBP42 proteins, and
their in vitro and in vivo capacities to bind RNA. Proteomics data and cellular analysis
point to a relevant implication of SCD6 and RBP42 proteins as regulators for a wide group
of transcripts in Leishmania.Doctor en Ciencias BiológicasDoctorad
